Protein A磁珠通常用于將抗體與血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清或腹水分離，以及利用免疫沉淀和共同免疫沉淀從細(xì)胞或組織提取物中分離抗原的蛋白質(zhì)。Protein A 磁性珠含有重組蛋白 A，可以特異性結(jié)合小鼠、人類、兔子、豬、狗和貓等多種種屬來源的抗體,使其成為研究和凈化免疫球蛋白的更通用、更方便的工具。

產(chǎn)品優(yōu)勢

具有高效的蛋白結(jié)合能力。

超低非特異性吸附的性能。

配合磁力架操作省時、簡便、溫和。

產(chǎn)品穩(wěn)定性高。

訂購信息

常溫運(yùn)輸。4℃保存，有效期 24 個月。

技術(shù)參數(shù)

貼壁細(xì)胞樣品

移去培養(yǎng)基，用 PBS 洗細(xì)胞兩次。

收集細(xì)胞至 1.5 mL EP 管內(nèi)，按比例加入 IP Lysis/Wash Buffer，同時加入 PMSF 等相應(yīng)的抑制劑，混勻后置于冰上靜置 5-20 min（期間混勻幾次）。

4 ℃, 12000-16000 g,10 min 離心收集上清液，置于冰上以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)（或置于-80 ℃長期保存）。

表 1.培養(yǎng)皿 IP Lysis/Wash Buffer 推薦使用體積

懸浮細(xì)胞樣品

4℃、500-1000 g、10 min，收集細(xì)胞，棄上清。

用 PBS 洗細(xì)胞一次，即用 PBS 將細(xì)胞團(tuán)重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收集細(xì)胞，棄上清。

用預(yù)冷的 IP Lysis/Wash Buffer 重懸細(xì)胞。每 50mg 細(xì)胞使用 500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時加入 PMSF 等相應(yīng)的抑制劑，混勻后置于冰上靜置 5-20 min（期間混勻幾次）。

4 ℃, 12000 -16000 g,10 min 離心收集上清液，置于冰上以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)（或置于-80 ℃長期保存）。

血清樣品

一般建議建議用 IP Lysis/Wash Buffer 稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為 50~150 µg/mL，置于冰上備用（或置于-20 ℃長期保存）。

免疫復(fù)合物的制備

【注】：樣品所需的量和孵育時間均依賴于每個特定的抗體-抗原體系，因而可能需要優(yōu)化才能得到最大產(chǎn)量。

以下實(shí)驗(yàn)方案針對 2-10μg 親和純化的抗體，根據(jù)需要可以按比例放大。

在離心管中，將每個樣品的細(xì)胞裂解液與 2-10μg 免疫沉淀抗體結(jié)合。每個免疫沉淀反應(yīng)推薦的總蛋白量為 500-1500μg。

用 IP Lysis/Wash Buffer 將抗體以及制備好的樣品稀釋至 300-500μL。

在室溫下孵育 1-2 h，或 4 ℃過夜，以形成免疫復(fù)合物。

免疫沉淀

【注】：為保證磁珠均勻分布，使用前通過反復(fù)顛倒或輕微渦旋混勻瓶中磁珠。

1.將 25µL(0.25 mg)的 Protein A Magnetic Beads 加入 1.5 mL 離心管中。

2.向磁珠中加入 500 µL 預(yù)冷 PBS，輕柔混勻。

3.將離心管放入磁力架中收集磁珠到離心管的一邊。去除上清。

4.向離心管中加入 200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻 1min。用磁力架收集磁珠。去除上清。

5.將抗原樣品/抗體混合物加入裝有磁珠的離心管中，保持混勻室溫下孵育 1-2 h。

6.用磁力架收集磁珠，除去未結(jié)合的樣品，保存以備分析。

7.向離心管中加入 500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻。收集磁珠，棄上清。再重復(fù)洗兩次。

8.變性洗脫：向離心管中加入 80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將樣品置于 100℃水浴或者金屬浴中加熱 10 min。通過磁力架分離磁珠，保留含有目的抗原的上清。

【注】：如需保持蛋白活性，也可采用以下洗脫方式。

低 pH 洗脫：向離心管中加入 100 µL Elution Buffer。保持混勻在室溫下孵育離心管 5-10 min。通過磁力分離磁珠，保留含有目的抗原的上清。每 100 µL 洗出液中加入 20 µL Neutralization Buffer 來中和低 pH。

注意事項(xiàng)

1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會導(dǎo)致磁珠聚集而降低結(jié)合能力。

3.IP 實(shí)驗(yàn)中不同類型的抗體與抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會受到 IP Lysis/WashBuffer 的影響，因此，如使用本實(shí)驗(yàn)步驟不能獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可自行優(yōu)化操作細(xì)節(jié)或者篩選及配制緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，推薦使用李記生物的相關(guān)產(chǎn)品，參照相關(guān)產(chǎn)品推薦。

4.磁珠使用前應(yīng)充分振蕩均勻。磁珠應(yīng)保存在儲存溶液中，防止干燥。

附錄：蛋白 A 與不同種類的 Ig，s 及其亞類的結(jié)合強(qiáng)度

相關(guān)產(chǎn)品推薦

1XPBS（無菌）（貨號：AC08L011）

Western/IP 細(xì)胞裂解液（帶抑制劑）（貨號：AP01L076）

蛋白示蹤上樣緩沖液（5 x）（貨號： AP14L036）